Главный герой в Assassin's Creed 2 примет роль Эцио Аудиторе де Фиренце, аристократа во времена буйства клана Борджиа. На протяжении всего слешера от третьего лица мы встретимся с четой Медичи, узнаем больше подробностей о Леонардо Да Винчи и Никколо Макиавелли. В то же время нашими врагами будут Борджиа, Франческо Пацци и Джироламо Савонарола. Продолжение истории Дезмонда Майлза, который попался в руки современного аналога Тамплиеров, проходит в эпоху Возрождения с 1476 по 1499 года.

Среди двух организаций ведется ожесточенная интеллектуальная битва. Объект 16 похищает Дезмонда, чтобы тот научился лучше владеть своими предками и стал настоящим ассасином, в то время как Тамплиеры хотели лишь завладеть информацией о Частицах Эдема.